如何鉴定超螺旋、开口和环形质粒DNA

当学生第一次准备质粒DNA时,我最喜欢的就是让他们在琼脂糖凝胶上检测一下质粒DNA。通常让他们跑两个样品:未经酶切的质粒DNA和经某一限制酶切割成线性的质粒DNA。

我会让他们尝试弄明白未经切割的质粒DNA的条带模式(为什么能看到2-3条带?),以线性DNA的单一条带为对照(为什么线性化以后所有的条带就都变成一条了?)。

我认为这种训练很有意义,因为只有理解了DNA的性质与本质才能了解其在琼脂糖凝胶上所呈现的带型。

在这篇文章中,我将重点讨论在凝胶上观察到的最常见的未经酶切的质粒DNA的四种形式,以及如何识别它们。

在我的下一篇文章中,我将介绍如何尽量增加我们想要的超螺旋质粒DNA。

一种DNA,多种形式:为什么未经酶切的质粒 DNA在琼脂糖凝胶上电泳时有3条带

当未切割的质粒DNA被抽提出来并在琼脂糖凝胶上电泳时,你可以观察到两个、三个甚至四个或更多条带。理想状态下,大部分DNA都是超螺旋状态,但其他形式也可能出现。这些形式在琼脂糖凝胶上的带型(相对迁移速度而言)如下图所示:

下面,我会带你了解每种条带的来源。

1. 超螺旋质粒(Supercoiled)

超螺旋DNA是体内发现的原生DNA构象(即质粒DNA在细胞内的自然存在形式),其因DNA双螺旋链发生额外的扭曲形成。人们经常将DNA的形式比作缠绕的橡皮筋或电话线(我相信你们中的一些人应该还记得带线的电话!)如果你过度扭曲橡皮筋或电话线,他们就会相互缠绕缩紧。

在DNA质粒中,这种超螺旋无法缓解,因为质粒的末端是连接在一起的。由于其独特的构象,超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速度比预期的要快。超螺旋DNA也是我们分离质粒DNA时所最想得到的。

2. 带切口的,松散的,或环形质粒(Nicked)

超螺旋DNA不容易通过复制机制获得。在复制过程中,细胞的拓扑异构酶会将DNA双螺旋的一条链切开一个口子,释放超螺旋张力,从而使聚合酶能够进入DNA。使用橡皮筋类比,带切口的DNA就是没有任何扭曲的橡皮筋。这种大的松散的环形DNA在琼脂糖凝胶中迁移的最慢。

3. 线性质粒(Linear)

当DNA双螺旋的两条链在同一位置被切开时,就会形成线性DNA。线性DNA的迁移速度通常位于带切口的环形DNA和超螺旋DNA之间。但是,它也可能与带切口的环形DNA跑到相同的位置——它的迁移与预期的DNA长度相同(与标准分子量相比)。

你也可以通过比较未切割的质粒DNA与使用限制酶线性化的质粒DNA来识别琼脂糖凝胶上的线性DNA。如果你想得到超螺旋DNA,但(例如在DNA质粒抽提后)却得到了线性DNA时,很可能是由于核酸酶污染或在抽提过程中的力度太大。

4. 圆形、单链质粒(Circular, single-stranded)

在碱性裂解提取质粒DNA时,质粒会因为氢键被碱性条件破坏而变性。但是,共价封闭的环形链仍然完好无损,并在拓扑结构上受到限制,当pH值恢复中性后氢键重新形成,超螺旋DNA也重新形成。

然而,如果碱性裂解步骤过于苛刻(例如孵育太久),DNA可能会永久变性,形成没有用的单链闭环DNA,在凝胶中迁移在其他所有类型的最前面。

成功的DNA质粒提取

虽然DNA质粒抽提可以得到多种形式的DNA,但你想要的只是能成功用于克隆和转化的:超螺旋。所以确保你知道如何尽可能多的获得质量良好的超螺旋DNA。以上内容否有助于你理解为什么你在琼脂糖凝胶电泳质粒DNA时会得到三个条带?如果有任何其他质粒提取的小技巧欢迎评论。

参考文献

  1. Dr Rebecca Tirabassi. How to Identify Supercoils, Nicks and Circles in DNA Plasmid Preps.  https://bitesizebio.com/13524/how-to-identify-supercoils-nicks-and-circles-in-plasmid-preps/, 2021.04.27.
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